출처:
Zhang, Jiashuo, et al. “Whole mitochondrial genome analyses of Han population from Shandong of China using massively parallel sequencing.” Frontiers in Genetics 15 (2024): 1513412.

산동 한족(韓族)의 모계 유전적 특성 분석 논문 해설

이 연구는 중국 산동성에 거주하는 한족 141명의 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 전체를 분석하여 그들의 모계 유전적 뿌리와 역사를 탐구했다. 연구 결과, 산동 한족은 대부분 동아시아 고유의 모계 혈통을 가지고 있으며, 특히 황하 및 서요하(西遼河) 유역에 살았던 고대인들과 매우 깊고 직접적인 유전적 관계를 맺고 있는 것으로 밝혀졌다. 동시에 이 지역의 핵심적인 토착 유전자 풀이 외부의 다양한 모계 혈통을 통합해 온 과정 또한 확인되었다. 또한, 약 9,000년 전 신석기 시대 농업의 발달과 함께 인구가 크게 증가한 역사적 패턴도 확인되었다. 이 연구는 미토콘드리아 DNA 전체를 분석하는 것이 일부만 분석하는 것보다 훨씬 더 정확하고 많은 정보를 제공한다는 점을 보여주며, 앞으로 법의학이나 고고학 연구에 중요한 기초 자료가 될 것이다.

1. 서론: 왜 미토콘드리아 DNA를 연구하는가?

우리 몸의 세포 안에는 핵 DNA와 미토콘드리아 DNA(mtDNA)라는 두 종류의 유전 정보가 있다. 핵 DNA가 부모 양쪽으로부터 물려받는 반면, 미토콘드리아 DNA는 오직 어머니를 통해서만 자녀에게 전달된다. 이는 mtDNA를 추적하면 ‘어머니의 어머니, 그 어머니의 어머니’로 이어지는 모계 혈통을 마치 족보처럼 따라갈 수 있다는 의미이다.

과학자들은 다음과 같은 특징 때문에 mtDNA 연구를 중요하게 생각한다.

• 모계 유전: 혈통 추적이 명확하다.
• 높은 변이 속도: 핵 DNA보다 돌연변이가 빠르게 일어나서, 인류가 어떻게 이동하고 분화했는지 더 세밀하게 파악할 수 있다.
• 풍부한 양과 강한 내구성: 세포 하나당 수백, 수천 개가 존재하고 구조가 안정적이어서 오래된 뼈나 머리카락처럼 손상된 시료에서도 추출하기 용이하다.

이러한 장점 덕분에 mtDNA는 인류의 기원과 이동 경로를 밝히는 고고학, 집단의 유전적 구조를 연구하는 집단 유전학, 그리고 신원 확인에 사용되는 법의학 등 다양한 분야에서 핵심적인 도구로 활용된다.

과거에는 기술적 한계로 mtDNA의 특정 일부 영역(주로 조절 영역, Control Region)만을 분석했다. 하지만 이는 마치 책의 한 챕터만 읽고 전체 내용을 추측하는 것과 같아서 정보가 부족했다. 이 연구에서는 대량 병렬 시퀀싱(Massively Parallel Sequencing, MPS)이라는 최신 기술을 사용해 mtDNA 전체 유전 정보(마치 책 전체를 읽는 것처럼)를 한 번에 빠르고 정확하게 분석했다.

이 연구의 주된 대상은 산동 지역의 한족이다. 한족은 중국에서 가장 큰 민족 집단이며, 산동은 역사적으로나 문화적으로 매우 중요한 지역이다. 하지만 그동안 산동 한족의 모계 유전적 특성에 대한 심도 있는 연구는 부족했다. 따라서 이 연구는 141명의 산동 한족 mtDNA 전체를 분석하여 그들의 유전적 다양성, 기원, 그리고 주변 민족들과의 관계를 깊이 있게 밝히는 것을 목표로 삼았다.

2. 연구 방법: 유전 정보를 어떻게 얻고 분석했나?

연구 과정은 다음과 같이 요약할 수 있다.

1. 시료 채취: 산동성에 거주하는 혈연관계가 없는 건강한 한족 141명(남성 79명, 여성 62명)으로부터 타액(침) 샘플을 채취했다.
2. DNA 추출 및 분석: 타액에서 DNA를 추출한 후, 대량 병렬 시퀀싱(MPS) 기술을 이용해 각 개인의 미토콘드리아 DNA 전체 서열을 읽어냈다. 이 기술은 수많은 DNA 조각을 동시에, 그리고 매우 빠르게 읽어내는 획기적인 방법이다.
3. 데이터 정리 및 분석: 컴퓨터 프로그램을 사용하여 분석된 방대한 DNA 데이터를 정리하고, 기준이 되는 인간 mtDNA 참조 서열(rCRS)과 비교하여 각 개인의 유전적 변이를 확인했다.
4. 하플로그룹 분류: 분석된 mtDNA 서열을 바탕으로 각 개인이 어떤 모계 유전 그룹, 즉 하플로그룹(Haplogroup)에 속하는지 분류했다. 하플로그룹은 공통의 모계 조상을 가진 사람들의 집단을 의미하며, 인류의 큰 가지와 같다고 볼 수 있다.
5. 집단 비교: 산동 한족의 유전적 위치를 파악하기 위해, 전 세계 다른 인구 집단(동아시아, 남아시아, 유럽 등) 및 고대인들의 mtDNA 데이터와 비교 분석했다.

3. 결과 및 토의: 무엇을 발견했는가?

3.1. 산동 한족의 모계 유전적 구성 (하플로그룹 분포)

연구 결과, 141명에게서 총 135개의 고유한 mtDNA 서열(하플로타입)과 105개의 세부적인 모계 혈통(하플로그룹)이 확인되었다.

주요 발견은 다음과 같다.

• 대부분이 동아시아 혈통: 분석 대상의29%가 동아시아에서 유래한 하플로그룹에 속했다. 이는 산동 한족의 모계 유전적 뿌리가 동아시아에 깊게 자리 잡고 있음을 명확히 보여준다.
• 주요 하플로그룹: 가장 흔하게 발견된 상위 그룹은 D (24.82%), F (17.02%), A (9.93%), B (9.22%) 순이었다.
  • 하플로그룹 D: 특히 중국 북부 지역에서 많이 발견되는 유형으로, 산동 한족이 북방계 인구와 깊은 관련이 있음을 시사한다. 특히 주목할 점은 D4 하위 그룹이 73%라는 매우 높은 비율로 나타난다는 것이다. 이는 이 모계 혈통이 이 지역의 매우 중요하고 핵심적인 유전적 구성 요소임을 의미한다. 더욱이 이 혈통은 약 9,500년 전 고대 산동 유골에서도 발견되어, 이 지역에서 수천 년간 단절 없이 이어진 매우 강력한 토착 혈통임을 알 수 있다.
  • 하플로그룹 F, B: 주로 중국 남부와 동남아시아에서 많이 나타나는 유형이다. 이는 산동 한족의 형성 과정에 남방계 인구의 유입과 혼합이 있었음을 보여준다.
• 소수의 유럽계 혈통: 흥미롭게도 단 1명에게서 유럽 특이적인 하플로그룹 X2 (0.71%)가 발견되었다. 이는 아주 먼 과거에 유럽계 인구와의 제한적인 유전적 교류가 있었을 가능성을 암시한다.

[그림 1] 산동 한족의 모계 혈통 나무

이 그림은 산동 한족에서 발견된 mtDNA 하플로그룹들의 관계를 보여주는 원형의 ‘가계도’이다.

• 중심과 가지: 그림의 중심(L3)은 아프리카를 벗어난 현생 인류의 가장 오래된 공통 모계 조상에 해당한다. 여기서부터 N과 M이라는 두 개의 큰 가지가 뻗어 나온다.
• 하위 그룹과 비율: N과 M 가지에서 다시 A, B, D, F, G 등 더 작은 가지들(하플로그룹)이 분화한다. 각 그룹 이름 옆의 숫자는 전체 141명 중 해당 그룹이 차지하는 비율을 의미한다.
  • D 그룹 (초록색, 24.82%): 가장 큰 비중을 차지하는 그룹으로, 산동 한족의 핵심 모계 혈통 중 하나임을 보여준다.
  • F 그룹 (파란색, 17.02%): 두 번째로 큰 그룹이다.
  • A 그룹 (빨간색, 9.93%) 과 B 그룹 (주황색, 9.22%) 도 상당한 비율을 차지한다.
• 의미: 이 그림은 산동 한족의 모계 유전 구성이 소수의 지배적인 혈통이 아닌, 여러 다양한 동아시아 고유 혈통들이 복합적으로 섞여 이루어진 매우 다양한 집단임을 시각적으로 보여준다.

3.2. 유전적 다양성 및 mtDNA 전체 분석의 우수성

유전적 다양성은 한 집단 내에 얼마나 다양한 유전적 특성이 존재하는지를 나타내는 척도이다. 다양성이 높을수록 그 집단이 여러 기원을 가진 사람들로 구성되었을 가능성이 크다.

[표 1] mtDNA 분석 범위에 따른 통계 비교

이 표는 mtDNA의 일부(조절 영역)만 분석했을 때와 전체를 분석했을 때의 결과를 비교하여, 전체 분석이 왜 중요한지 명확하게 보여준다.

• 더 많은 정보: 전체를 분석했을 때 유전적 차이점(변이)을 3배 이상 더 많이 발견했다 (1,500개 vs 5,054개). 이는 더 깊고 세밀한 분석이 가능함을 의미한다.
• 더 높은 정확성: 더 많은 고유 서열(하플로타입)과 혈통(하플로그룹)을 구분해낼 수 있었다.
• 더 뛰어난 식별력: 두 사람을 무작위로 뽑았을 때 우연히 mtDNA 서열이 같을 확률(일치 확률)이 더 낮아지고(-15.22%), 반대로 두 사람을 구별할 수 있는 능력(개인 식별 능력)은 더 높아졌다(0.9574). 이는 법의학에서 신원을 확인할 때 매우 중요한 장점이다.

결론적으로, 이 표는 mtDNA 전체를 분석하는 것이 부분 분석에 비해 월등히 우수하며, 집단의 유전적 구조를 더 정확하게 이해하고 미묘하지만 역사적으로 중요한 유전적 연결고리를 놓치지 않게 해주는 데 필수적임을 증명한다.

3.3. 다른 인구 집단과의 유전적 관계

[그림 2] 주성분 분석(PCA)으로 본 산동 한족의 유전적 위치

주성분 분석(PCA)은 여러 인구 집단의 복잡한 유전 정보를 2차원 그래프에 점으로 표시하여 집단 간의 유전적 거리와 유사성을 한눈에 보여주는 분석법이다. 유전적으로 가까운 집단일수록 그래프 상에서 가깝게 위치한다.

• 그림 2A (유라시아 집단과 비교): 이 그래프는 산동 한족을 유럽, 남아시아, 동아시아 등 유라시아( Eurasia) 대륙의 여러 집단과 비교한 것이다.
  • 그래프를 보면 유럽인, 남아시아인, 동아시아인들이 각각 뚜렷한 그룹을 형성하고 있다.
  • 산동 한족은 동아시아 집단(East Asian) 무리 안에 정확히 위치하며, 특히 북경 한족(CHB), 남방 한족(CHS)과 매우 가깝게 붙어있다. 이는 산동 한족이 다른 한족 집단과 강한 모계 유전적 유대를 공유하고 있음을 보여준다.

• 그림 2B (중국 내 한족 집단과 비교): 이 그래프는 범위를 좁혀 중국 내 여러 지역의 한족 집단들만 비교한 것이다.
  • 그래프 상에서 북방 한족과 남방 한족이 어느 정도 구분되는 경향을 보인다.
  • 산동 한족은 북경, 하북 등 다른 북방 한족 집단과 함께 묶여 있다. 이는 지리적 위치와 유전적 구조가 일치하는 결과로, 북방 한족이 공통의 모계 유전적 역사를 공유하고 있음을 시사한다.

[그림 3] 고대인과의 유전적 연결망 (하플로그roup D4 네트워크 분석)

이 그림은 현대 산동 한족에서 가장 높은 빈도(17.73%)를 보이는 하플로그룹 D4에 속하는 사람들과, 황하(黃河) 유역 및 서요하 유역에서 발굴된 고대인들의 mtDNA를 비교한 ‘관계망’이다. 이 분석은 산동 지역의 인구 역사를 이해하는 데 가장 중요한 단서를 제공한다.

• 점과 선의 의미: 각 원은 하나의 mtDNA 서열(하플로타입)을 나타내며, 원의 크기는 해당 서열을 가진 사람 수를 의미한다. 색깔은 집단을 구분하는데, 빨간색 원이 현대 산동 한족이고 다른 색들은 고대인 집단이다. 선은 유전적 관계를 나타내며, 선에 표시된 작은 눈금(tick) 하나가 돌연변이 하나를 의미하므로, 선이 짧고 눈금이 적을수록 유전적으로 가깝다는 뜻이다.
• 강력한 연속성과 ‘동방 유전 공동체’의 발견: 그림을 보면, 다수의 빨간색 원(현대인)들이 약 9,500년에서 1,800년 전 사이 같은 지역에 살았던 노란색(고대 산동인) 및 초록색(고대 황하 하류인) 원들과 직접 연결되거나 매우 가깝게 위치한다. 이는 현대 산동 한족이 수천 년 전 동시대 조상의 후손이라는 강력한 증거이다. 특히 논문은 현대 산동인(山東人)과 고대 산동 및 황하(黃河) 하류 집단 사이에서 하플로그룹 D4a, D4b, D4e와 같은 세부 하위 그룹들이 직접적으로 공유되는 것을 명확히 보여준다. 이는 이 지역의 모계 혈통이 외부 집단에 의해 대체되지 않고 수천 년에 걸쳐 매우 안정적으로 유지되었음을 구체적인 유전자형으로 증명하는 것이다.
• 주변 지역과의 교류 및 서요하와의 깊은 관계: 이 분석에서 특히 강조되는 점은 산동과 서요하 유역의 유전적 연결성이다. 서요하 유역은 신석기 시대 홍산문화(紅山文化)의 중심지로, 고대 동북아시아 문명의 중요한 발원지 중 하나이다. 논문에 따르면, 고대 서요하 유역 사람들 사이에서 특징적으로 나타났던 하플로그룹 D4j가 현대 산동 한족에게서도 명확히 발견되었다. 이 특정한 유전자 표식(D4j)의 공유는 우연의 일치로 보기 어려운 강력한 증거로, 두 지역이 선사 시대에 단순한 문화 교류를 넘어 실질적인 인구 이동과 혈연관계를 공유하는 하나의 거대한 ‘동방 유전 공동체’였을 가능성을 시사한다. 이 발견은 고고학적으로 오랫동안 관찰되어 온 두 지역 문화의 유사성을 생물학적 데이터로 뒷받침하는 매우 중요한 결과이다.
• 지리적으로 다른 집단과의 융합 증거: 이 그림에서 가장 주목해야 할 점은 현대 산동인 한 명이 지리적으로 멀리 떨어진 황하 상류(Upper Yellow River) 유역의 고대인과 매우 가깝게 군집을 이루는 것이다. 두 사람 사이의 유전적 차이는 단 3개의 돌연변이에 불과했다. 이는 먼 과거 어느 시점에 서쪽 지역(황하 상류)의 모계 혈통이 동쪽의 산동 인구 집단으로 이주하여 합류했음을 보여주는 직접적인 유전학적 증거다.
• 새로운 혈통의 등장과 통합의 역사: 반면 D4h, D4k와 같은 일부 하위 그룹에서는 고대인과의 연결 없이 현대인(빨간색 원)만 나타난다. 논문은 이를 두고 산동 한족이 발전 과정에서 “다른 지역으로부터 상당수의 모계 혈통을 통합(integrated)”해왔을 가능성을 시사한다. 이는 이 지역의 역사가 외부 인구에 의한 대체가 아니라, 강력한 토착 인구 기반 위에서 외부의 다양한 유전자를 점진적으로 흡수하고 통합해 온 역사임을 보여준다.

3.4. 산동 한족의 인구 역사 추정

[그림 4] 베이즈 스카이라인 분석(BSP)을 통한 과거 인구 변화 추정

베이즈 스카이라인 분석(BSP)은 현재 인구의 유전적 다양성 데이터를 바탕으로 과거 수만 년 동안 인구 크기(특히 모계 유효 집단 크기)가 어떻게 변해왔는지를 통계적으로 추정하는 그래프이다. 이 분석은 앞서 확인된 산동 지역 토착 집단의 저력이 어디서 비롯되었는지 설명해준다.

• 그래프 읽는 법: 가로축은 과거로 거슬러 올라가는 시간(단위: 년)이고, 세로축은 인구 크기를 나타낸다. 파란색 실선이 추정된 인구 크기 변화이며, 주변의 음영은 95% 신뢰 구간을 의미한다.
• 그림 4A (산동 한족):
  • 그래프를 보면, 산동 한족의 인구는 약 6만 년 전부터 완만하게 성장하기 시작했다.
  • 가장 주목할 점은 약 9,000년 전부터 인구가 다시 한번 뚜렷하게 증가하는 모습이다. 이 시기는 인류 역사에서 수렵 채집 생활을 끝내고 농사를 짓기 시작한 신석기 시대와 일치한다.
  • 이는 농업의 도입으로 식량 생산이 안정되면서 더 많은 인구를 부양할 수 있게 되었고, 이것이 산동 지역의 인구 팽창을 이끌었다는 고고학적 증거와 일치하는 결과이다. 중요한 점은, 이처럼 이른 시기에 이미 크고 안정적인 인구 기반이 형성되었다는 것이다. 이 강력한 인구 기반이 있었기에, 후대에 외부 집단과 교류하는 과정에서도 쉽게 동화되지 않고 오히려 외부 혈통을 흡수하며 자신들의 유전적 중심을 지킬 수 있었던 것이다.

• 그림 4B (북경 한족):
  • 비교를 위해 분석한 북경 한족의 데이터에서도 약 1만 년 전을 기점으로 유사한 인구 증가 패턴이 나타난다. 이는 농업의 발달이 중국 북부 지역 전체의 인구 성장에 큰 영향을 미쳤음을 재확인시켜 준다.

4. 정리

이 연구는 최신 유전체 분석 기술을 통해 산동 한족의 모계 유전적 역사를 깊이 있게 조명했다.

1. 고품질 데이터베이스 구축: 산동 한족 141명의 mtDNA 전체 서열 데이터를 확보하여 국제 데이터베이스(EMPOP)에 등록했다. 이는 향후 관련 연구의 중요한 기초 자료가 될 것이다.
2. mtDNA 전체 분석의 중요성 입증: 유전 정보의 일부가 아닌 전체를 분석하는 것이 개인 식별 능력과 유전적 해상도를 극적으로 높여, 법의학 및 집단 유전학 연구에 훨씬 더 유용함을 증명했다.
3. 유전적 기원과 복합적 형성 과정 확인: 산동 한족은 신석기 시대부터 이어진 강력한 토착 모계 혈통을 중심으로, 서쪽(황하 상류)을 포함한 주변 지역의 다양한 혈통을 점진적으로 흡수하고 통합하며 형성되었음이 확인되었다.
4. 인구 팽창과 농업의 연관성: 유전 데이터를 통해 약 9,000년 전 신석기 시대에 시작된 인구 팽창을 확인했으며, 이는 이 지역의 강력한 인구 기반이 농업의 발달이라는 인류사의 중요한 사건과 깊은 관련이 있음을 시사했다.

결론적으로, 이 연구는 산동 한족의 유전적 구성을 상세히 밝혀냈을 뿐만 아니라, 그들의 역사적 뿌리와 발전 과정을 이해하는 데 중요한 과학적 단서를 제공했다. 이 데이터는 미래의 고고학 연구와 법의학적 신원 확인에 매우 귀중하게 활용될 잠재력을 가지고 있다.

Whole mitochondrial genome analyses of Han population from Shandong of China using massively parallel sequencing

중국 산동 한족 집단의 전체 미토콘드리아 게놈을 대량 병렬 시퀀싱으로 분석한 연구

Jiashuo Zhang1, XueBo Li2,3, Anqi Chen4, Mingxia Ding5, Liangliang Li2,3, Yinghua Qi2,3, Chunli Ding2,3, Dawei Cai1* and Suhua Zhang4*
1 School of Archaeology, Jilin University, Changchun, Jilin, China,
2 Key Laboratory of Evidence Identification in Universities of Shandong Province, Shandong University of Political Science and Law, Jinan, Shandong, China,
3 Institute of Forensic Science, Shandong University of Political Science and Law, Jinan, Shandong, China,
4 Institute of Forensic Science, Fudan University, Shanghai, China,
5 Obstetrics and Gynecology Department, Second Hospital of Shandong University, Jinan, Shandong, China

장지아숴(Jiashuo Zhang)1, 리쉐보(XueBo Li)2,3, 천안치(Anqi Chen)4, 딩밍샤(Mingxia Ding)5, 리량량(Liangliang Li)2,3, 치잉화(Yinghua Qi)2,3, 딩춘리(Chunli Ding)2,3, 차이다웨이(Dawei Cai)1*, 장수화(Suhua Zhang)4*
1 중국 길림대학(吉林大學) 고고학원, 길림성 장춘,
2 산동성 대학 증거감정 중점실험실, 산동정법대학, 산동성 제남,
3 산동정법대학 법의학연구소, 산동성 제남,
4 복단대학(復旦大學) 법의학연구소, 상해,
5 산동대학 제2병원 산부인과, 산동성 제남

Introduction: Mitochondrial DNA (mtDNA) has been extensively utilized in archeology, human evolutionary genetics, and forensic genetic for over three decades, primarily due to its maternal inheritance and relatively high mutation rate. The Chinese Han, the largest and most widely distributed ethnic group in China, have been the focus of numerous genetic studies. However, the forensic parameters and genetic structure of the Shandong Han, specifically in relation to the whole mitochondrial genome, remain undocumented.

서론: 미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 모계 유전과 비교적 높은 돌연변이율 때문에 지난 30여 년 동안 고고학, 인류 진화 유전학, 법의 유전학에서 널리 활용되어 왔다. 중국 최대이자 가장 널리 분포한 민족인 한족(漢族)은 수많은 유전학 연구의 중심이 되어왔다. 그러나 산동 한족의 전체 미토콘드리아 게놈과 관련된 법의학적 지표와 유전 구조는 아직 보고된 바 없다.

Methods: We performed whole mitochondrial genome sequencing on 141 unrelated Han individuals from Shandong province using massively parallel sequencing.

방법: 우리는 산동성 출신의 혈연관계가 없는 141명의 한족 개인을 대상으로 전체 미토콘드리아 게놈을 대량 병렬 시퀀싱(MPS)으로 분석했다.

Results: A total of 135 unique mtDNA haplotypes were identified, classified into 105 haplogroups, resulting in a haplotype diversity value of 0.9993. The discriminatory capacity of whole mitochondrial genome was calculated at 0.9574, compared to 0.8936 when only the control region was analyzed. The majority of the haplogroups observed were specific to East Asian lineages, including D4, D5 and F1. Population comparisons revealed that the modern Shandong Han share genetic connections with ancient populations from the Yellow River and West Liao River basins. Additionally, the Shandong Han may have integrated a significant number of maternal lineages from other regions during their development. The demographic expansion of the Shandong Han is estimated to have occurred approximately 9,000 years ago, corresponding to the Neolithic period, a time of significant cultural and technological development.

결과: 총 135개의 고유 mtDNA 하플로타입이 확인되었고, 105개의 하플로그룹으로 분류되었다. 그 결과 하플로타입 다양성 값은 0.9993으로 나타났다. 전체 미토콘드리아 게놈의 판별력은 0.9574로 계산되었는데, 이는 대조(control) 영역만 분석했을 때의 0.8936보다 높았다. 관찰된 하플로그룹 대부분은 동아시아 특유의 계통에 속했으며, 대표적으로 D4, D5, F1 등이 있었다. 집단 비교 결과, 현대 산동 한족은 황하(黃河)와 서요하(西遼河) 유역의 고대 인구와 유전적 연결을 공유하는 것으로 나타났다. 또한 산동 한족은 그 형성과정에서 다른 지역의 모계 계통을 상당수 받아들였을 가능성이 있다. 산동 한족의 인구 확장은 약 9,000년 전 신석기 시대에 일어난 것으로 추정되며, 이는 문화와 기술이 크게 발전한 시기와 일치한다.

Discussion: The dataset generated in this study is available in the EMPOP database under the accession number EMP00886 and will serve as an important mtDNA reference for forensic casework in China. The study of whole mitochondrial genome based on the analysis of matrilineal genetic structure of the Shandong Han population can help to enrich the forensic mtDNA reference database in East Asia and provide reference for future archeology and forensic genetics research.

논의: 본 연구에서 생산된 데이터세트는 EMPOP 데이터베이스에 EMP00886 번호로 등록되어 있으며, 중국 법의학 사례에서 중요한 mtDNA 참고 자료로 활용될 것이다. 산동 한족의 모계 유전 구조를 기반으로 한 전체 미토콘드리아 게놈 연구는 동아시아 법의학 mtDNA 데이터베이스를 풍부하게 하고, 향후 고고학 및 법의학 유전학 연구에 참고자료를 제공할 수 있다.

1 Introduction

Human mitochondrial DNA (mtDNA) possesses several unique characteristics, such as high copy number per cell, absence of recombination, rapid mutational rate, and maternal inheritance. These features make mtDNA a powerful tool across a variety of fields, including medical genetics, anthropology, population genetics, archeology, and forensic genetics (Derenko et al., 2007; Murphy, 2018; Simão et al., 2018; Wang et al., 2020; Ning et al., 2021; Lintao et al., 2024; Zheng et al., 2024). Its value is especially evident in ancient DNA analysis and forensic applications, where DNA samples are often highly fragmented or degraded, such as in bones, nails and hair shafts without roots (Irfan et al., 2024; Li et al., 2024), which may lack sufficient nuclear DNA. Due to its robustness, mtDNA is commonly used when nuclear DNA is either unavailable or inadequate for analysis.

Historically, researches have focused on sequencing the hypervariable regions Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ (HV Ⅰ, HV Ⅱ and HV Ⅲ) of the non-coding control region (CR), along with a selection of specific single nucleotide polymorphisms (SNPs) from the coding region (CodR) (Hong et al., 2015; Chaitanya et al., 2016). However, the CR alone offers limited polymorphism data, which can reduce the effectiveness of mtDNA analysis in forensic casework. Studies have shown that more than 70% of mtDNA variants are located outside the hypervariable regions, highlighting the advantage of sequencing the entire mitochondrial genome for greater discrimination and precise haplogroup classification (Brotherton et al., 2013; Zhou et al., 2016).

Traditionally, mtDNA analysis relied on Sanger sequencing, a time-consuming and inefficiency method, making large-scale mtDNA sequencing projects impractical (Ma et al., 2018). Massively parallel sequencing (MPS), by contrast, offers a more efficient approach, yielding higher throughput data with increased resolution. This technological advancement allows for the creation of larger and more detailed mtDNA databases, significantly enhancing genetic research (King et al., 2014). The EMPOP database (https://empop.online/), which now includes 48,572 quality-controlled mitotypes, has benefited substantially from MPS-based mtDNA sequencing. Among these, 46,963 mitotypes cover HVS-I and HVS-II, 38,361 span the entire CR, and 4,289 represent complete mitochondrial genomes.

The Han Chinese population, the largest ethnic group in the world with a population of approximately 1.4 billion, has been of great interest to researchers in fields such as anthropology, archaeology, and forensic genetics (Liu et al., 2021). As the dominant ethnic group in China and Singapore (Chen et al., 2019), understanding the origins, migration patterns, and genetic relationships of the Han people is crucial for the study of East Asian populations. Shandong province, in particular, plays a significant historical and cultural importance, especially as the birthplace of Confucianism (Rong and Bahauddin, 2023). According to the seventh national population census, Han Chinese account for 99.11% of Shandong’s population. Despite this, previous studies on the Shandong Han population, particularly from the perspective of maternal inheritance, have been limited in both sample size and scope, often focusing only on HV I, HV II, and CR data (Yao et al., 2002b).

Moreover, ancient DNA studies suggest that ancient Shandong people genetically related to both Northern and Southern East Asian populations (Liu et al., 2021). Therefore, a comprehensive analysis of the complete mitochondrial genome would provide a deeper understanding of the genetic diversity and population dynamics in the region.

In this study, we sequenced the complete mitochondrial genomes of 141 healthy, unrelated Han individuals from Shandong using MPS technology. We performed a detailed analysis of haplogroup distribution, genetic diversity, point heteroplasmy, and maternal genetic structure within the Shandong Han population. Additionally, to further explore the genetic relationships between the Shandong Han and populations across Asia and Europe, we conducted principal component analyses (PCA) and network analyses. This research aims to enhance our understanding of the genetic makeup of the Shandong Han and provide valuable insights for future studies in population genetics, archaeology, and forensic science.

인간 미토콘드리아 DNA(mtDNA)는 세포당 높은 복제 수, 재조합의 부재, 빠른 돌연변이율, 모계 유전 등 몇 가지 독특한 특성을 지닌다. 이러한 특징 때문에 mtDNA는 의학 유전학, 인류학, 집단 유전학, 고고학, 법의학 유전학 등 다양한 분야에서 강력한 도구로 활용된다(Derenko et al., 2007; Murphy, 2018; Simão et al., 2018; Wang et al., 2020; Ning et al., 2021; Lintao et al., 2024; Zheng et al., 2024). 특히 고대 DNA 분석과 법의학 응용에서 그 가치가 뚜렷하게 드러난다. 왜냐하면 뼈, 손톱, 뿌리 없는 모발 등에서 얻은 DNA는 흔히 심하게 파편화되거나 손상되어 충분한 핵 DNA를 포함하지 못하기 때문이다(Irfan et al., 2024; Li et al., 2024). 이러한 강건성 때문에 핵 DNA가 없거나 분석에 부족할 때 mtDNA가 흔히 사용된다.

역사적으로는 비암호화 대조 구역(control region, CR)의 초가변 영역(HVⅠ, HVⅡ, HVⅢ)과 암호화 구역(CodR)의 특정 단일염기다형성(SNPs)을 분석하는 데 초점이 맞추어져 왔다(Hong et al., 2015; Chaitanya et al., 2016). 그러나 CR만으로는 제한된 다형성 정보를 제공하기 때문에 법의학적 사례에서 mtDNA 분석의 효과가 떨어진다. 연구에 따르면 mtDNA 변이의 70% 이상이 초가변 영역 바깥에 존재하며, 이는 전체 미토콘드리아 게놈을 시퀀싱하는 것이 더 나은 판별력과 정밀한 하플로그룹 분류에 유리함을 보여준다(Brotherton et al., 2013; Zhou et al., 2016).

전통적으로 mtDNA 분석은 시간이 많이 걸리고 비효율적인 생거(Sanger) 시퀀싱에 의존했기 때문에 대규모 mtDNA 시퀀싱 프로젝트는 실행하기 어려웠다(Ma et al., 2018). 반면 대량 병렬 시퀀싱(MPS)은 훨씬 효율적인 접근법을 제공하여, 더 많은 처리량과 높은 해상도의 데이터를 산출한다. 이 기술적 진보 덕분에 더 크고 세밀한 mtDNA 데이터베이스를 구축할 수 있게 되었으며, 이는 유전학 연구를 크게 향상시켰다(King et al., 2014). 현재 EMPOP 데이터베이스(https://empop.online/)에는 품질 관리된 48,572개의 미토타입이 수록되어 있으며, 이는 MPS 기반 mtDNA 시퀀싱의 혜택을 크게 받은 것이다. 이 가운데 46,963개는 HVS-I과 HVS-II, 38,361개는 전체 CR, 4,289개는 전체 미토콘드리아 게놈을 포함한다.

한족은 세계에서 가장 큰 민족 집단으로 약 14억 명에 달하며, 인류학·고고학·법의학 유전학 등 여러 분야에서 큰 관심을 받아왔다(Liu et al., 2021). 중국과 싱가포르의 주류 민족으로서(Chen et al., 2019), 한족의 기원, 이동 패턴, 유전적 관계를 이해하는 것은 동아시아 집단 연구에서 매우 중요하다. 특히 산동성은 공자 사상의 발원지로서 중요한 역사적·문화적 의미를 가진다(Rong and Bahauddin, 2023). 제7차 인구 센서스에 따르면 산동 인구의 99.11%가 한족이다. 그럼에도 불구하고 산동 한족을 대상으로 한 기존 연구는 모계 유전의 관점에서 표본 규모와 범위가 제한적이었고, HVⅠ, HVⅡ, CR 데이터만을 중심으로 분석하는 경우가 많았다(Yao et al., 2002b).

게다가 고대 DNA 연구에 따르면 고대 산동인은 동아시아 북부와 남부 인구 모두와 유전적으로 연관된 것으로 나타났다(Liu et al., 2021). 따라서 전체 미토콘드리아 게놈에 대한 종합적 분석은 이 지역의 유전적 다양성과 인구 역학을 더 깊이 이해하는 데 도움이 될 것이다.

본 연구에서는 산동 출신의 건강한 혈연관계가 없는 한족 141명의 전체 미토콘드리아 게놈을 MPS 기술로 시퀀싱했다. 이를 통해 산동 한족 집단 내 하플로그룹 분포, 유전적 다양성, 점 이형성(heteroplasmy), 모계 유전 구조를 상세히 분석했다. 또한 산동 한족과 아시아·유럽 여러 집단 간 유전적 관계를 탐구하기 위해 주성분분석(PCA)과 네트워크 분석을 실시했다. 본 연구의 목적은 산동 한족의 유전적 구성에 대한 이해를 심화시키고, 향후 집단 유전학·고고학·법의학 연구에 귀중한 통찰을 제공하는 것이다.

2 Materials and methods

2.1 Sample preparation and ethical statement

Saliva samples were collected from 141 unrelated Han individuals (79 males and 62 females) in Shandong province, China. Written informed consent was obtained from each participant. This study was approved by the Ethics Committee of the Scientific Research Institute at the Second Hospital of Shandong University (approval number: KYLL-2020(LW)-055) and adhered to the ethical guidelines of the World Medical Association (Association, 2013). All procedures were conducted in accordance with the principles of Declaration of Helsinki.

2 재료 및 방법

2.1 시료 준비와 윤리적 승인

중국 산동성에서 혈연관계가 없는 한족 141명(남성 79명, 여성 62명)으로부터 타액 시료를 채취했다. 모든 참가자로부터 서면 동의서를 받았다. 본 연구는 산동대학 제2병원 과학연구소 윤리위원회의 승인을 받았으며(승인 번호: KYLL-2020(LW)-055), 세계의학협회 윤리 지침(Association, 2013)을 준수했다. 모든 절차는 헬싱키 선언 원칙에 따라 진행되었다.

2.2 DNA extraction, library construction and sequencing

Genomic DNA was extracted from the saliva samples using the QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN, Germany) according to the manufacturer’s instructions. The concentration of gDNA was measured using the Invitrogen Qubit 4 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific, United States). For downstream applications, the gDNA was normalized to 5 ng/μL and stored at −20°C until amplification.

DNA library construction was conducted using the MultipSeq™ AimumiCap Panel (Enlighten biotechnology company, China), which utilizes 129 paired primers for the PCR amplification of the entire mitochondrial genome. A non-template library negative control and a library positive control were introduced during library preparation. The multiplex PCR amplification was carried out in a 30 μL reaction mixture containing 1 μL of template DNA (5 ng/μL), 5 μL of RealCapChrMT Mix, 10 μL of 3×Enzyme HF and 14 μL of nuclease-free water. The PCR cycling conditions were as follows: an initial denaturation at 98°C for 3 min; 13 cycles of 98°C for 20 s and 58°C for 4 min; followed by 7 cycles of 98°C for 20 s and 72°C for 1 min; and a final extension at 72°C for 2 min. The amplified products were purified using Agencourt AMPure XP beads (Beckman Coulter, United States).

A second round of PCR amplification was carried out to add adapters and indexes. This reaction volume, with a total volume of 30 μL, included 10 μL 3×Enzyme HF, 18 μL of purified PCR products, 1 μL of I5 index, and 1 μL of I7 index. The thermal cycling reaction were: 98°C for 2 min; 6 cycles of 98°C for 15 s, 58°C for 15 s, and 72°C for 15 s; followed by a final extension at 72°C for 2 min.

After quantification, the libraries were sequenced using paired-end sequencing on the Illumina HiSeq X Ten platform. All mtDNA sequencing and subsequent data analysis were conducted according to the standards set by the International Society of Forensic Genetics (ISFG) and the U.S. Scientific Working Group on DNA Methods (SWGDAM) (Methods, 2013; Parson et al., 2014; Connell et al., 2022).

2.2 DNA 추출, 라이브러리 제작 및 시퀀싱

타액 시료로부터 게놈 DNA는 QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN, 독일)를 사용해 제조사 지침에 따라 추출했다. gDNA 농도는 Invitrogen Qubit 4 형광계(Thermo Fisher Scientific, 미국)를 사용하여 측정했다. 이후 분석을 위해 gDNA는 5 ng/μL로 표준화하고, 증폭 전까지 −20°C에 보관했다.

DNA 라이브러리 제작은 Enlighten 생명공학(중국)에서 개발한 MultipSeq™ AimumiCap Panel을 사용해 진행했는데, 이는 전체 미토콘드리아 게놈 증폭을 위해 129쌍의 프라이머를 활용한다. 라이브러리 준비 과정에서는 무템플릿 음성 대조군과 양성 대조군을 함께 도입했다. 다중 PCR 증폭은 30 μL 반응액(템플릿 DNA 1 μL[5 ng/μL], RealCapChrMT Mix 5 μL, 3×Enzyme HF 10 μL, 무핵산수 14 μL)에서 수행되었다. PCR 사이클 조건은 다음과 같았다: 98°C에서 3분간 초기 변성, 이어서 13회 사이클(98°C 20초, 58°C 4분), 그 뒤 7회 사이클(98°C 20초, 72°C 1분), 마지막으로 72°C 2분간 최종 연장. 증폭된 산물은 Agencourt AMPure XP beads(Beckman Coulter, 미국)를 사용해 정제했다.

두 번째 PCR 증폭은 어댑터와 인덱스를 추가하기 위해 수행했다. 총 30 μL 반응액은 3×Enzyme HF 10 μL, 정제된 PCR 산물 18 μL, I5 인덱스 1 μL, I7 인덱스 1 μL로 구성되었다. 열순환 조건은 98°C 2분, 이후 6회 사이클(98°C 15초, 58°C 15초, 72°C 15초), 마지막으로 72°C 2분이었다.

정량화 후, 라이브러리는 Illumina HiSeq X Ten 플랫폼에서 페어엔드 시퀀싱을 통해 분석되었다. 모든 mtDNA 시퀀싱 및 후속 데이터 분석은 국제법유전학회(ISFG)와 미국 DNA 방법 과학작업그룹(SWGDAM)이 제정한 표준을 따랐다(Methods, 2013; Parson et al., 2014; Connell et al., 2022).

2.3 Sequencing data analyses

Redundant primers and indexes were removed using the Cutadapt software (https://github.com/marcelm/cutadapt/), and low-quality reads were filtered using Trimmomatic v0.39 (https://github.com/usadellab/Trimmomatic). The cleaned data were then aligned to the revised Cambridge Reference Sequence plus 64 bp using the BWA alignment tool. To minimize the potential for false positives caused by nuclear mitochondrial DNA (NUMTs) contamination, the sequences were also compared with the human reference genome hg19.

Reads successfully mapped to hg19 were extracted with Bedtools and realigned to rCRS, generating updated BAM files using Bowtie2 (Langmead and Salzberg, 2012). Mutation sites were identified, and variant data were exported in VCF format using GATK, Angsd, and Mia software (McKenna et al., 2010; Schönberg et al., 2011; Korneliussen et al., 2014). The final consensus sequence in FASTA format was generated with the Consensus.py script (https://github.com/TaizoAyase/consensus_creator).

2.3 시퀀싱 데이터 분석

중복된 프라이머와 인덱스는 Cutadapt 소프트웨어(https://github.com/marcelm/cutadapt/)로 제거했으며, 저품질 리드(read)는 Trimmomatic v0.39(https://github.com/usadellab/Trimmomatic)를 사용해 필터링했다. 정제된 데이터는 BWA 정렬 도구를 사용해 개정된 케임브리지 기준서열(rCRS)에 64 bp를 추가한 서열에 맞추었다. 핵 내 미토콘드리아 DNA(NUMTs) 오염으로 인한 위양성 가능성을 최소화하기 위해, 서열은 인간 참조 게놈 hg19와도 비교했다.

hg19에 성공적으로 매핑된 리드는 Bedtools로 추출한 후 rCRS에 재정렬했으며, Bowtie2(Langmead and Salzberg, 2012)를 사용해 업데이트된 BAM 파일을 생성했다. 돌연변이 위치를 확인하고, 변이 데이터는 GATK, Angsd, Mia 소프트웨어를 통해 VCF 형식으로 내보냈다(McKenna et al., 2010; Schönberg et al., 2011; Korneliussen et al., 2014). 최종 합의 서열은 Consensus.py 스크립트(https://github.com/TaizoAyase/consensus_creator)를 사용해 FASTA 형식으로 생성했다.

2.4 MtDNA haplogroup assignment

The haplogroups of whole mtDNA sequences from the Shandong Han population were identified using HaploGrep3 (https://haplogrep.i-med.ac.at/) based on PhyloTree build 17 (Van Oven and Kayser, 2009). To ensure accuracy, the haplogroups were further validated using the SAM2 tool (Huber et al., 2018) integrated into EMPOP (Parson and Dür, 2007). The EMPOP tools “EMPcheck” and “network” were adopted to identify and correct potential errors in the dataset. The finalized sequence data were submitted to EMPOP, and only quality-controlled mtDNA sequences were retained for subsequent population comparison analyses.

2.4 mtDNA 하플로그룹 판정

산동 한족 집단의 전체 mtDNA 서열 하플로그룹은 HaploGrep3(https://haplogrep.i-med.ac.at/)을 사용해 PhyloTree build 17(Van Oven and Kayser, 2009)을 기반으로 판정했다. 정확성을 보장하기 위해, 하플로그룹은 EMPOP에 통합된 SAM2 도구(Huber et al., 2018)를 사용해 추가로 검증했다(Parson and Dür, 2007). 또한 EMPOP 도구 “EMPcheck”와 “network”를 활용해 데이터셋 내 잠재적 오류를 식별하고 교정했다. 최종 확정된 서열 데이터는 EMPOP에 제출되었고, 이후 집단 비교 분석에서는 품질 관리된 mtDNA 서열만 사용되었다.

2.5 Statistical analyses

Haplogroup and haplotype frequencies in this study were derived from whole mitochondrial sequences and calculated using the direct counting method. The haplotype match probability (HMP) was defined as HMP = Σpi², where pi represents the frequency of the i-th haplotype. Haplotype diversity (HD) was calculated using the formula HD = n(1 − Σpi²)/(n − 1), where n is the sample size and pi represents the frequency of the i-th haplotype (Purps et al., 2014). The discrimination capacity (DC) was defined as the ratio between the number of distinct haplotypes and the total number of haplotypes (Purps et al., 2014). The nucleotide diversity (π), the number of segregating sites (S), neutrality tests (Tajima’s D and Fu’s Fs tests), and the average number of pairwise nucleotide differences (K) were estimated using DnaSP v6 based on the whole mitochondrial genomes (Rozas et al., 2017).

2.5 통계 분석

본 연구의 하플로그룹 및 하플로타입 빈도는 전체 미토콘드리아 서열에서 직접 계수법으로 산출했다. 하플로타입 일치 확률(HMP)은 HMP = Σpi²로 정의했으며, 여기서 pi는 i번째 하플로타입의 빈도를 의미한다. 하플로타입 다양성(HD)은 HD = n(1 − Σpi²)/(n − 1) 공식을 사용해 계산했으며, 여기서 n은 표본 수, pi는 i번째 하플로타입의 빈도이다(Purps et al., 2014). 판별력(DC)은 서로 다른 하플로타입 수를 전체 하플로타입 수로 나눈 값으로 정의했다(Purps et al., 2014). 염기서열 다양성(π), 분리 부위 수(S), 중립성 검정(Tajima’s D 및 Fu’s Fs), 쌍별 평균 염기 차이 수(K)는 DnaSP v6(Rozas et al., 2017)을 사용해 전체 미토콘드리아 게놈 기반으로 추정했다.

2.6 Population comparisons

To investigate the genetic relationships between the Shandong Han population and other global populations, we obtained 1,514 complete mitochondrial sequences from 15 populations across East Asia, South Asia, and Europe through the 1000 Genomes Project. Additionally, 188 mitochondrial genomes from five populations across North and West Asia were collected from the Human Genome Diversity Project (HGDP). A further 16,375 mtDNA sequences were collected from 26 provinces across China, along with 36 ancient mitochondrial genomes. Detailed information on all reference populations is provided in Supplementary Table S3.

The haplogroup of each reference mitochondrial genome (mitogenome) was identified using the HaploGrep3 (https://haplogrep.i-med.ac.at/). All reference FASTA files were aligned with MAFFT (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/) and merged into our dataset (Rozewicki et al., 2019). The PCA was performed on haplogroups frequencies using the FactoMineR v2.11 in R software (https://cran.r-project.org/web/packages/FactoMineR/index.html).

To further examine specific mtDNA haplogroups, a network analysis was conducted using the median-joining method in Popart (https://popart.maths.otago.ac.nz/) (Leigh et al., 2015). A Bayesian skyline plot (BSP) was generated with BEAST2 2.7.0 to infer the demographic history of the Shandong Han population applying the TN93 (Chen et al., 2020). The molecular clock was calibrated using the mutation rate defined by Soares et al. (2009). Tracer v1.7 (https://github.com/beast-dev/tracer/releases/tag/v1.7.2) was used to assess the convergence of the runs, ensuring effective sampling size (ESS) and to reconstruct the population dynamics over time (Rambaut et al., 2018).

2.6 집단 비교

산동 한족과 전 세계 다른 집단의 유전적 관계를 조사하기 위해, 동아시아·남아시아·유럽 15개 집단에서 1,514개의 전체 미토콘드리아 서열을 1000 Genomes Project로부터 확보했다. 또한 북아시아와 서아시아 5개 집단에서 188개의 미토콘드리아 게놈을 Human Genome Diversity Project(HGDP)에서 수집했다. 더불어 중국 26개 성(省)에서 16,375개의 mtDNA 서열과 36개의 고대 미토콘드리아 게놈을 추가로 확보했다. 모든 참조 집단에 대한 상세 정보는 보조자료 표 S3에 제시되어 있다.

각 참조 미토콘드리아 게놈(미토게놈)의 하플로그룹은 HaploGrep3(https://haplogrep.i-med.ac.at/)을 사용해 판정했다. 모든 참조 FASTA 파일은 MAFFT(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)로 정렬한 후 데이터셋에 통합했다(Rozewicki et al., 2019). PCA는 하플로그룹 빈도에 기반해 R 소프트웨어의 FactoMineR v2.11(https://cran.r-project.org/web/packages/FactoMineR/index.html)을 사용해 수행했다.

특정 mtDNA 하플로그룹을 더 자세히 살펴보기 위해, Popart(https://popart.maths.otago.ac.nz/)의 median-joining 방법을 사용해 네트워크 분석을 수행했다(Leigh et al., 2015). 또한 BEAST2 2.7.0을 사용해 베이지안 스카이라인 플롯(BSP)을 생성하여 산동 한족의 인구학적 역사를 추론했다(Chen et al., 2020). 분자시계는 Soares et al.(2009)이 정의한 돌연변이율로 보정했다. 분석 수렴 여부와 효과적 표본 크기(ESS)는 Tracer v1.7(https://github.com/beast-dev/tracer/releases/tag/v1.7.2)을 통해 평가했으며, 시간에 따른 인구 동태를 재구성했다(Rambaut et al., 2018).

3 Results and discussion

3.1 Quality control

The whole mitochondrial genomes generated in this study were carefully reviewed by two independent scientists. Consistent mtDNA haplotypes were then submitted to the EMPOP database (https://empop.online/). A total of 141 mtDNA haplotypes (listed in Supplementary Table S1) were validated and approved by EMPOP colleagues and are now accessible through the EMPOP browser under accession number EMP00886.

The average number of mapped reads per individual was 505,209 ± 171,486, with an overall mean read depth of 3,721× ± 1,241× per individual (as illustrated Supplementary Figure S1). In general, higher sequencing depth increases the confidence in calling a variant at a specific location. As shown in Supplementary Figure S1, the average read depth for all individuals ranged from 445× to 7,615×, suggesting a considerable degree of reliability. This robust coverage suggests that the MultipSeq™ AimumiCap panel kit from Enlighten Biotechnology Company (Shanghai, China) performed well in capturing complete mitochondrial genomes, demonstrating its effectiveness for comprehensive mitogenome sequencing. The consistency of the read depth across the samples underscores the reliability of the kit for high-throughput genetic analysis.

3 결과 및 논의

3.1 품질 관리

본 연구에서 생산된 전체 미토콘드리아 게놈은 두 명의 독립된 과학자에 의해 신중하게 검토되었다. 일관된 mtDNA 하플로타입은 EMPOP 데이터베이스(https://empop.online/)에 제출되었다. 총 141개의 mtDNA 하플로타입(보조자료 표 S1에 수록됨)이 EMPOP 연구진에 의해 검증 및 승인되었으며, 현재 EMP00886 번호로 EMPOP 브라우저를 통해 접근 가능하다.

개인별 평균 매핑 리드는 505,209 ± 171,486개였으며, 전체 평균 시퀀싱 깊이는 개인당 3,721× ± 1,241×였다(보조그림 S1 참조). 일반적으로 시퀀싱 깊이가 깊을수록 특정 위치의 변이를 신뢰성 있게 판별할 수 있다. 보조그림 S1에 나타난 바와 같이, 전체 개인의 평균 시퀀싱 깊이는 445×에서 7,615×까지 분포하여 높은 신뢰성을 시사한다. 이러한 안정적인 커버리지는 중국 상해의 Enlighten Biotechnology Company가 제작한 MultipSeq™ AimumiCap 패널 키트가 전체 미토콘드리아 게놈을 포착하는 데 뛰어난 성능을 보였음을 보여준다. 표본 간 깊이가 일관되게 유지된 점은 해당 키트가 대량 처리 유전학 분석에 신뢰할 수 있음을 입증한다.

3.2 MtDNA haplogroup distribution

A total of 105 haplogroups and 135 haplotypes were identified from the 141 complete mitochondrial genomes of the Shandong Han population, as shown in Supplementary Table S1. These haplogroups were determined using HaploGrep3 based on PhyloTree build 17 and verified manually. The matrilineal ancestry of the Shandong Han population was predominantly composed of East Asian-specific lineages (99.29%), with a small presence of the European-specific haplogroups X2 (0.71%) (see Figure 1) (Kivisild et al., 2002; Kong et al., 2003; Reidla et al., 2003). This strong representation of East Asian lineages reflects the population’s genetic heritage, while the minor presence of haplogroup X2 points to limited genetic input from Europe.

The East Asian-specific lineages were primarily distributed across various sub-haplogroups of M, including D (24.82%), G (7.8%), Z (7.8%), and M7 (5.67%), with an additional 1.42% classified as M10. Other significant haplogroups included A (9.93%), B (9.22%), F (17.02%), Y (2.84%), N9a (3.55%), and N10 (1.42%), all of which fall under the N sub-haplogroup.

3.2 mtDNA 하플로그룹 분포

산동 한족의 141개 전체 미토콘드리아 게놈으로부터 총 105개의 하플로그룹과 135개의 하플로타입이 확인되었다(보조자료 표 S1 참조). 이 하플로그룹은 PhyloTree build 17을 기반으로 HaploGrep3을 사용해 판정했으며, 수작업으로 검증했다. 산동 한족의 모계 계통은 주로 동아시아 특유의 계통(99.29%)으로 구성되었고, 유럽 특유 하플로그룹 X2가 소량(0.71%) 존재했다(그림 1 참조) (Kivisild et al., 2002; Kong et al., 2003; Reidla et al., 2003). 동아시아 계통의 강한 비중은 집단의 유전적 유산을 반영하며, X2 하플로그룹의 소수 존재는 유럽으로부터의 제한적 유전적 유입을 시사한다.

동아시아 특유 계통은 주로 M 하위그룹에 분포했으며, D(24.82%), G(7.8%), Z(7.8%), M7(5.67%), 그리고 M10(1.42%) 등이 포함되었다. 그 외 주요 하플로그룹으로는 A(9.93%), B(9.22%), F(17.02%), Y(2.84%), N9a(3.55%), N10(1.42%) 등이 있었으며, 이들은 모두 N 하위그룹에 속했다.

3.3 MtDNA genetic diversity and heteroplasmy

It is note that the haplotype F1a1c was observed in three individuals and four haplotypes (F1a1, M9a1a1c1a, D4j15 and D4) were shared between two individuals each. The value of HD was calculated at 0.9993, with a DC of 0.9574. The value of HMP was determined to be 0.0078. Several genetic diversity metrics were also calculated, including the number of polymorphic (segregating) sites (535), nucleotide diversity (0.0019 ± 0.0004), and the average number of pairwise differences (31.418 ± 1.1291), all of which provide insights into the effective population size of the Shandong Han.

Neutrality tests, such as Tajima’ D (−2.2369) and Fu’s Fs (−32.7860), yielded significantly negative results, indicating potential recent population expansions or evidence of positive selection in the Shandong Han. Table 1 presents a summary of statistics for the CR, CodR, and whole mtDNA sequence data.

Compared to the CR data alone, the whole mtDNA sequence analysis demonstrated a 15.22% reduction in HMP, while the number of unique haplogroups, unique haplotypes, and haplotype diversity increased by 15.24%, 6.67%, and 0.15%, respectively. Moreover, the discriminatory capacity increased from 0.8936 with CR haplotypes to 0.9574 with the inclusion of whole mtDNA sequences in the Shandong Han samples.

3.3 mtDNA 유전적 다양성과 이형성

하플로타입 F1a1c는 세 명의 개인에서 관찰되었고, 네 개의 하플로타입(F1a1, M9a1a1c1a, D4j15, D4)은 각각 두 명의 개인에서 공유되었다. 하플로타입 다양성(HD)은 0.9993으로 계산되었고, 판별력(DC)은 0.9574였다. 하플로타입 일치 확률(HMP)은 0.0078로 산출되었다. 또 다른 지표로 다형성(분리) 위치 수(535), 염기 다양성(0.0019 ± 0.0004), 쌍별 평균 염기 차이 수(31.418 ± 1.1291)가 계산되었으며, 이는 산동 한족의 유효 인구 크기에 대한 통찰을 제공한다.

중립성 검정에서 Tajima’s D(−2.2369)와 Fu’s Fs(−32.7860)는 유의하게 음의 값을 보여, 최근 인구 확장 가능성 혹은 양의 선택 작용의 증거를 시사했다. 표 1에는 CR, CodR, 전체 mtDNA 서열 데이터의 통계 요약이 제시되어 있다.

CR 데이터만 분석한 경우와 비교하면, 전체 mtDNA 서열 분석은 HMP를 15.22% 줄였고, 고유 하플로그룹 수, 고유 하플로타입 수, 하플로타입 다양성은 각각 15.24%, 6.67%, 0.15% 증가했다. 또한 CR 하플로타입 기반 판별력은 0.8936이었으나, 전체 mtDNA 서열을 포함한 산동 한족 샘플에서는 0.9574로 향상되었다.

3.4 Genetic relationship of the Shandong Han with other populations

To explore the genetic relationships between the Shandong Han population and Eurasia populations, PCAs were performed using haplogroup frequencies from Eurasia and China datasets (Supplementary Table S3). As illustrated in Figure 2, the PCA of Eurasia populations revealed five genetically distinct cluster: European, East Asian, North Asian, South Asian, and West Asian. The first two components explain 21.4% of the total variance (PC1: 11.3%, PC2: 10.1%). PC1 differentiated South Asian populations from the other reference populations, while PC2 primarily separated Europe populations from the rest. The Shandong Han population was located within the broader East Asian cluster, closely aligned with the Beijing Han (CHB) and Southern Han (CHS) groups (Figure 2A), indicating a strong genetic connection between these populations.

3.4 산동 한족과 다른 집단의 유전적 관계

산동 한족과 유라시아 집단 간의 유전적 관계를 탐구하기 위해, 유라시아 및 중국 데이터셋의 하플로그룹 빈도를 기반으로 PCA를 수행했다(보조자료 표 S3). 그림 2에 나타난 바와 같이, 유라시아 집단의 PCA는 유럽, 동아시아, 북아시아, 남아시아, 서아시아 등 다섯 개의 뚜렷한 유전적 군집을 보여주었다. 첫 두 성분은 총 변이의 21.4%를 설명했으며(PC1: 11.3%, PC2: 10.1%), PC1은 남아시아 집단을 다른 참조 집단과 구분했고, PC2는 주로 유럽 집단을 나머지와 구분했다. 산동 한족은 동아시아 군집 내에 위치했으며, 북경 한족(CHB)과 남방 한족(CHS) 집단과 밀접하게 정렬되어 이들 집단 간 강한 유전적 연결을 시사했다.

To further investigate the genetic structure of the Shandong Han and examine population substructure among different Han groups, a separate PCA was conducted using only Chinese Han data. The first two components accounted for 17% of the genetic variation (PC1: 9.7% and PC2: 7.3%). PC1 distinguished Northern China Han populations from Southern China Han populations, while PC2 separated Eastern Han groups from those in Northwest China (Figure 2B). The positioning of the Shandong Han, Beijing Han and Hebei Han populations in the PCA closely matched their geographic locations, suggesting that their maternal genetic composition reflects historical migration patterns and genetic contributions from various groups during the development of the Han population in China.

These results provide insights into the genetic diversity within the Han population, as well as the broader connections between East Asian populations and their neighboring regions in Asia and Europe.

To further explore the genetic background of the Shandong Han population, we analyzed the whole mitochondrial genomes of 36 ancient individuals from the Yellow River Basin, West Liao River Basin and Shandong, constructing genetic networks (Supplementary Table S3; Figure 3). In this study, haplogroup D4 was found at a high frequency (17.73%) in the Shandong Han population, with numerous downstream clades. Previous genome-wide studies of ancient populations from Northern East Asia, particularly those from the Yellow River Basin and the West Liao River Basin, have also identified haplogroup D4 as a prevalent type in these regions (Ning et al., 2020).

In recent research on maternal genetic structures, D4 was the dominant haplogroup in ancient Shandong populations between 9,500 and 1,800 years ago (Liu et al., 2021). As illustrated in Figure 3, we observed a strong genetic connection between the modern Shandong Han and ancient individuals from Shandong and the Lower Yellow River Basin, particularly within the sub-haplogroups D4a, D4b and D4e. Additionally, haplogroup D4j, which was common in ancient populations of the West Liao River Basin, was also present in modern Shandong Han. One Shandong Han individual belonging to sub-haplogroup D4g clustered with an ancient individual from Upper Yellow River Basin, with only three mutation difference.

Interestingly, sub-haplogroup D4h and D4k, which were not detected in the ancient populations, were discovered at the modern Shandong Han. This suggests that while the Shandong Han population shares significant genetic ties with ancient populations from the Yellow River and West Liao River Basins, their development likely involved the incorporation of maternal lineages from various sources.

To assess the population expansion timeline of the Shandong Han population, we conducted a Bayesian skyline plot (BSP) analysis using whole mitochondrial genome data. As illustrated in Figure 4A, the BSP reflects the effective population size of the Shandong Han over time. The population underwent a significant expansion starting approximately 60,000 years ago (ka). This expansion peaked around 40,000 years ago and continued at a slower pace until about 10,000 years ago, when the population size reached equilibrium. A more recent growth phase occurred approximately 9,000 years ago, coinciding with the Neolithic period.

A similar pattern of population growth was observed in the CHB (Figure 4B), with a notable increase in population size around 10,000 years ago. This timeline aligns with the agricultural development seen in the Central Plains, as reported in previous studies (He et al., 2017; Robbeets et al., 2021). Research has shown that the adoption of agriculture by prehistoric societies played a key role in driving rapid population expansion (Gowdy, 2020).

These findings highlight the close connection between population growth in the Shandong Han and broader historical events, particularly the shift to agricultural practices that transformed human societies during the Neolithic era.

산동 한족의 유전 구조를 더 깊이 조사하고 서로 다른 한족 집단 간의 하위구조를 살펴보기 위해, 중국 한족 데이터만을 사용해 별도의 PCA를 수행했다. 첫 두 성분은 전체 유전 변이의 17%를 설명했으며(PC1: 9.7%, PC2: 7.3%), PC1은 중국 북부 한족과 남부 한족을 구분했고, PC2는 동부 한족과 중국 서북부 한족을 구분했다(그림 2B). PCA에서 산동 한족, 북경 한족, 하북 한족의 위치는 실제 지리적 분포와 잘 일치했으며, 이는 이들의 모계 유전 구성이 중국 한족의 발전 과정에서 역사적 이동 패턴과 다양한 집단의 유전적 기여를 반영함을 시사한다.

이러한 결과는 한족 내부의 유전적 다양성뿐 아니라 동아시아 인구와 아시아 및 유럽 주변 지역 간의 더 넓은 연결성에 대한 통찰을 제공한다.

산동 한족의 유전적 배경을 더 탐구하기 위해, 황하 유역·서요하 유역·산동 지역 고대인 36명의 전체 미토콘드리아 게놈을 분석하여 유전 네트워크를 구축했다(보조자료 표 S3; 그림 3). 본 연구에서 산동 한족 집단에서는 하플로그룹 D4가 높은 빈도(17.73%)로 나타났으며, 하위 계통도 다양하게 존재했다. 북동아시아 고대 집단, 특히 황하 유역과 서요하 유역에서 수행된 이전 전장 게놈 연구에서도 D4 하플로그룹이 흔한 유형으로 확인된 바 있다(Ning et al., 2020).

최근의 모계 유전 구조 연구에서도 D4는 약 9,500년 전에서 1,800년 전 사이 고대 산동 인구에서 지배적인 하플로그룹이었다(Liu et al., 2021). 그림 3에서 보듯이, 현대 산동 한족과 산동 및 하류 황하 유역 고대인의 하위 그룹 D4a, D4b, D4e 사이에는 강한 유전적 연결이 확인되었다. 또한 서요하 유역 고대 집단에서 흔했던 D4j 하위 그룹도 현대 산동 한족에서 나타났다. 산동 한족의 한 개인은 D4g 하위 그룹에 속했으며, 이는 상류 황하 유역 고대인과 함께 군집되었는데 단 세 개의 돌연변이 차이만 있었다.

흥미롭게도 고대 집단에서는 발견되지 않았던 D4h와 D4k 하위 그룹이 현대 산동 한족에서는 확인되었다. 이는 산동 한족이 황하와 서요하 유역 고대 집단과 중요한 유전적 연계를 공유하지만, 그 발전 과정에서 다양한 기원의 모계 계통이 유입되었음을 시사한다.

산동 한족 인구 확장의 시기를 평가하기 위해, 전체 미토콘드리아 게놈 데이터를 활용하여 베이지안 스카이라인 플롯(BSP) 분석을 수행했다. 그림 4A에서 보듯이, BSP는 시간에 따른 산동 한족의 유효 인구 크기를 반영한다. 인구는 약 60,000년 전부터 본격적으로 확장되었고, 약 40,000년 전에 정점에 달했으며, 약 10,000년 전까지는 느린 속도로 증가하다가 평형에 도달했다. 이후 약 9,000년 전, 신석기 시대와 동시에 또 한 번의 인구 성장이 나타났다.

북경 한족(CHB)에서도 유사한 인구 성장 패턴이 관찰되었으며(그림 4B), 약 10,000년 전 인구 크기가 눈에 띄게 증가했다. 이 시기는 이전 연구에서 보고된 바와 같이 중원 지역의 농업 발전과 일치한다(He et al., 2017; Robbeets et al., 2021). 선사 사회에서 농업의 채택은 급속한 인구 확장을 이끈 핵심 요인이었음이 밝혀졌다(Gowdy, 2020).

이러한 결과는 산동 한족의 인구 성장과 신석기 시대 동안 인류 사회를 변화시킨 농업으로의 전환이라는 역사적 사건 사이의 긴밀한 연계를 보여준다.

4 Conclusion

The study generated and submitted the whole mitochondrial genome data for 141 Han individuals from Shandong, Northern China, to the EMPOP dataset (accession number EMP00886). The results highlight that whole mitochondrial genome sequencing significantly improves genetic resolution and provides robust data for analyzing genetic diversity and other population metrics. The analysis of mtDNA haplogroups revealed that the majority of haplogroups in the Shandong Han population belong to East Asian lineages.

Population analyses further indicated that the Shandong Han not only share genetic links with ancient population from the Yellow River and West Liao River basins but have also been influenced by neighboring populations. Additionally, the Shandong Han experienced significant population expansion during the Neolithic period, aligning with similar growth patterns observed in the CHB population.

In conclusion, the mitochondrial genome data generated in this study will contribute to existing mitochondrial DNA databases in Northern China, providing deeper insights into the genetic composition of the Shandong Han. This dataset holds valuable potential for future archaeological and forensic applications.

4 결론

본 연구는 중국 북부 산동 출신 한족 141명의 전체 미토콘드리아 게놈 데이터를 생성하여 EMPOP 데이터베이스(등록번호 EMP00886)에 제출했다. 연구 결과, 전체 미토콘드리아 게놈 시퀀싱은 유전 해상도를 크게 향상시키고 유전적 다양성과 다른 인구 지표 분석에 활용할 수 있는 신뢰성 있는 데이터를 제공한다는 점이 강조되었다. mtDNA 하플로그룹 분석에서는 산동 한족의 하플로그룹 대부분이 동아시아 계통에 속함이 드러났다.

집단 분석에서는 산동 한족이 황하와 서요하 유역 고대 인구와 유전적 연계를 공유할 뿐 아니라, 주변 집단의 영향도 받았음을 보여주었다. 또한 산동 한족은 신석기 시대 동안 중요한 인구 확장을 경험했으며, 이는 북경 한족(CHB)에서 관찰된 성장 패턴과도 일치했다.

결론적으로, 본 연구에서 생산된 미토콘드리아 게놈 데이터는 중국 북부의 기존 mtDNA 데이터베이스를 보완하고, 산동 한족의 유전적 구성에 대한 더 깊은 이해를 제공할 것이다. 이 데이터셋은 향후 고고학 및 법의학적 응용에 있어 중요한 잠재적 가치를 지닌다.

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